Výzkumný záměr Ú.Imunologie / Research Activity of D.of Immunology

V rámci řešení prvního hlavního cíle projektu - indukce specifické systémové imunitní odpovědi jako prevence systémových infekcí (borelióza, HIV-1 infekce) a povrchových kožních infekcí (trichofytóza) - budou navrženy a syntetizovány různé syntetické formy trimerní galaktózy lišící se délkou spojovací části mezi koncovou galaktózou a páteřním lipidem. Tyto syntézy budou provedeny formou zakázky u biochemických laboratoří , která byla již předem dojednána. Jednotlivé preparáty budou testovány in vitro a následně na zvířecích modelech s cílem najít optimální podmínky přípravy DNA/lipoplexů - sférických a kochleátových forem komplexních molekul kationického galaktosylovaného lipidu s negativně nabitou DNA. Kritickými body tohoto kroku je příprava dostatečně malých komplexů (<100 nm) s optimálním výsledným kationickým nábojem vyjadřovaným poměrem dusíku v kationickém lipidu a fosfátu v DNA (N/P = 1 - 3,5). Minimalizace kationického náboje je naopak nutná k snížení nespecifické interakce DNA/lipoplexů s negativně nabitým povrchem endotelií cév během putováním komplexů od místa vpichu k vstupu do Disseho prostorů. Uvedené kritické parametry je možno optimalizovat volbou iontové síly prostředí v průběhu přípravy komplexů DNA liposom a použitím uhlíkového extrudéru k selekci dostatečně malých komplexů. Jednotlivé preparace budou testovány in vitro na tkáňových kulturách srovnáváním transfekční účinnosti připravených komplexů na liniích exprimujících ASGPR (HepG2) a liniích bez ASGPR (293T, CHO, RD, ...). Nejlépe fungující preparace budou následně testovány u experimentálních myší s použitím nejdříve reporterových DNA plazmidů a potom jednotlivých DNA vakcín, jejichž efektivita bude hodnocena měřením specifické humorální a buněčné odpovědi. U vybraných infekčních modelů bude testována protektivita vybraného vakcinačního schématu při čelenžním experimentu (experimentální systémová kandidóza myší, experimentální borelióza myší).

V rámci řešení druhého hlavního cíle projektu - indukce specifické mukózní imunitní odpovědi jako prevence mukózně lokalizované infekce (vaginální kandidóza) a mukózami přenášené infekce (HIV-1 infekce) - budou připraveny DNA/lipoplexy se silně kationickým nábojem (hodnoty N/P = 3 - 10), které budou testovány in vitro a následně in vivo. V in vivo experimentech bude kladen důraz na sledování závislosti toxicity DNA/lipoplexů na N/P při intranazální a intravaginální aplikaci a současně bude sledována závislost transfekční účinnosti na N/P pomocí plazmidů s reportérovými geny. Optimalizované N/P bude použito pro přípravu DNA vakcín jejichž mukózní imunogenicita bude testována stanovením specifické humorální a buněčné mukózní odpovědi experimentálních myší na jednotlivé testované antigeny. Dále bude testována efektivita kombinace imunizace myší DNA/lipoplexy a rekombinantním proteinem při indukci specifické humorální odpovědi. Poslední část vakcinačních experimentů sledujících indukci intenzivní protektivní mukózní odpovědi na jednotlivé antigeny bude zaměřena na testování efektu kombinace systémového DNA primování a mukózního boosterování DNA nebo proteinovou vakcínou. Tato cesta je v poslední době preferována u různých antigenů včetně HIV-1 gp120 a je velmi efektivní jak vyplynulo i z našich předběžných experimentů s fúzním antigenem gp120+MBL.

Třetí hlavní cíl - testování fúzních DNA vakcín k modulaci antigen specifické imunitní odpovědi pro cílenou indukci humorální, nebo buněčné odpovědi jako prevence infekčních onemocnění, zánětlivých a alergických stavů - je zaměřen na využití imunomodulačních vlastností modulačních molekul OX40L, IFN-, J-domény k modulování antigen specifické imunitní odpovědi při imunizaci experimentálních myší pomocí vybraných antigenů popsaných výše u jednotlivých infekčních onemocnění. Imunomodulační efekt DNA vakcinace bude testován ve dvou základních formách DNA vakcíny: A) aplikace DNA vakcíny kódující konkrétní antigen společně s další DNA vakcínou kódující imunomodulační molekulu a B) vakcinace mono- nebo bi-cistronickou DNA vakcínou exprimující antigen i modulační molekulu. První přístup je výhodný zejména pro molekuly OX40L a IFN-, neboť umožňuje sledovat vhodný poměr exprimovaného antigenu a modulační molekuly (hodnoceno molárním množstvím jednotlivých aplikovaných DNA) a rovněž umožňuje pro příslušné kombinace antigenu a modulační molekuly nalézt optimální časové schéma aplikace obou DNA vakcín. Druhý přístup je naopak vhodný pro expresi fúzního antigenu (například antigen N´ terminálně fúzovaný s J-doménou). Uvedené modulační molekuly slouží pouze jako vzory jednotlivých typů moderního využití DNA vakcinace a jejich spektrum bude v průběhu řešení projektu dále rozšířeno ve shodě s novými poznatky o efektivní modulaci imunitní odpovědi Th1 nebo Th2 směrem.

Hodnocení specifické buněčné a humorální odpovědi imunizovaných zvířat bude stěžejní validační metoda pro jednotlivé imunizační schémata. Při hodnocení buněčné odpovědi budou stanoveny jednak intracelulární hladiny cytokinů (IL-2, IL-4, IL-15, IFN-) v jednotlivých subpopulacích splenocytů (CD4, CD8, CD27, CD28, CD45, CD127) po stimulaci antigenem in vitro pomocí FACS, a dále bude prováděna multiparametrická analýza efektorových buněk. Humorální imunitní odpověď bude vyhodnocována měřením dosažených titrů protilátek metodou ELISA konfirmovanou Westernovým imunoblotem.

Výzkumné cíle v oblasti mikrobiologie lze charakterizovat přístupem směřujícím k vývoji, rozšíření, zkvalitnění a urychlení diagnostických postupů v lékařské bakteriologii a mykologii, zejména v oblasti molekulární genetiky, dále rozšíření informací na poli epidemiologie systémových i lokálních infekcí bakteriálního a mykotického původu, včetně studia faktorů virulence jednotlivých kmenů. Dále budou ověřeny možnosti nových metod rychlé detekce patogenních organismů za využití fyzikálně chemických metod založených na interakci organizovaných vrstev nanočástic kovů.

Nedílnou součástí výzkumu je analýza mechanismů selekčního tlaku antibiotik vedoucího k multirezistenci, zejména u hojně rozšířených patogenů jako jsou např. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, enterokoky a enterobakterie. Na základě získaných výsledků pak formulovat postupy směřující k omezení vzniku a šíření rezistence v humánní i animální oblasti. Uvedený cíl dále souvisí s prevencí nozokomiálních nákaz vyvolaných multirezistentními bakteriemi, především u imunokompromitovaných (hemato-onkologických) pacientů.

Základním cílem výzkumu nových typů antibakteriálních a antimykotických látek na bázi nanočástic stříbra je vývoj takového systému, který bude dostatečně stabilní v biologickém prostředí a bude přitom vykazovat vysokou antibakteriální a antimykotickou aktivitu. Další cíl výzkumu představuje studium možnosti využití těchto látek, obsahujících nanočástice stříbra, jako prevence proti vzniku bakteriálního biofilmu.