Domů

Specifické cíle

  1. Návrh, syntéza a testování liposomálních nosičů DNA vakcíny schopných tvořit DNA/lipoplexy cíleně vychytávané ASGPR.
    1. návrh struktur pro značení kationických lipidů trimerní galaktózou testovaných pomocí DNA plazmidů exprimujících reportérové geny luciferázu, b-galaktosidázu.
      1. syntéza jednotlivých struktur formou zakázky.
      2. testování in vitro transfekční účinnosti DNA/lipoplex komplexů za různých N/P.
      3. testování podmínek pro přípravu DNA/lipoplexů s velikostí pod 100 nm.
      4. elektron-mikroskopická analýza distribuce velikosti DNA/lipoplexů v závislosti na podmínkách přípravy.
      5. testování in vivo transfekční účinnosti - dopravení DNA do jater u experimentálních myší.
      6. formulace závislosti účinnosti a specificity dopravení DNA k hepatocytům v závislosti na velikosti a N/P poměru DNA/lipoplexů.
      7. sledování orgánové distribuce DNA/lipoplexů s optimalizovaným N/P a velikostí.
      8. stanovení postranních efektů systémové aplikace optimalizovaných DNA/lipoplexů.
    2. využití optimalizovaných DNA/lipoplexů k imunizaci vybranými antigeny a měření buněčné a humorální imunitní odpovědi na vakcinaci.
      1. gp120+MBL.
      2. hsp60 T. mentagrophytes.
      3. hsp90 C. albicans.
    3. stanovení buněčné a humorální imunitní odpovědi na kombinované vakcinační postupy využívající DNA priming a DNA nebo proteinový booster v různých časových režimech.

      4. Hypotéza: Směrování DNA vakcíny do jater je velmi efektivní cesta indukující expresi dostatečného množství antigenu. Studium podmínek imunizace pro jednotlivé studované antigeny umožní stanovit optimální imunizační schémata a umožní zhodnotit obecný přínos směrování DNA vakcíny do jater.

  2. Příprava skupiny fúzních Osp antigenů odvozených od protektivních a non-autoimunogenních epitopů OspA, OspB a OspC B. afzelii a B. garinii.
    1. klování cDNA fúzních epitopů OspA, B, C a konstrukce DNA vakcíny.
    2. prokaryontní exprese fúzních Osp antigenů.
      1. purifikace rekombinantních proteinů - fúzních polyepitopů.
      2. testování imunogenicity rekombinantních proteinových vakcín a DNA vakcín.
        1. srovnání imunogenicity jednotlivých fúzních proteinů při systémové vakcinaci.
        2. zhodnocení zastoupení sérových protilátek specificky reagujících s jednotlivými epitopy.
      3. testování buněčné a humorální imunitní odpovědi na kombinované vakcinační postupy využívající DNA priming a DNA nebo proteinový booster v různých časových režimech.

      Hypotéza: Vakcinace fúzní Osp DNA vakcínou ve spojením se směrováním DNA do jater a kombinovaným imunizačním schématem představuje potenciálně vysoce efektivní cestu indukce protektivní humorální odpovědi vůči infekci B. afzelii nebo B. garinii.

  3. Testování negalaktosylovaných kationických lipidů pro přípravu DNA/lipoplexů určených k mukózní aplikaci.
    1. optimalizace podmínek přípravy DNA/lipoplexů s transfekčními kationickými lipidy typu DOTAP, DOPE, DOTMA, DC-Chol pomocí DNA vektorů exprimujících reportérové geny.
      1. testování in vitro transfekční účinnosti jednotlivých komplexů v závislosti na N/P.
      2. testování in vivo transfekční účinnosti v závislosti na N/P při aplikaci cestou
        1. intranazální
        2. intravaginální
        3. sledování postranních nežádoucích efektů v závislosti na N/P.
      3. formulace optimálních podmínek pro jednotlivé aplikační cesty.
    2. využití optimálních mukózních aplikačních forem k vakcinaci myší DNA exprimujícími antigeny hsp90 a gp120.
      1. testování mukózní buněčné a humorální imunitní odpovědi na hsp90 C. albicans.
      2. testování mukózní buněčné a humorální imunitní odpovědi na HIV-1 gp120.
      3. testování efektu mukózních adjuvans při imunizaci rekombinantními proteiny hsp90 C. albicans a HIV-1 gp120 měřením změn specifické mukózní humorální a buněčné odpovědi experimentálních myší.
        1. testování efektu Bacillus antracis edema toxinu.
        2. testování efektu B podjednotky cholerového toxinu.
        3. testování efektu tepelně labilního toxinu I E. coli.

      Hypotéza: Identifikace optimálních imunizačních schémat navazujících silnou mukózní odpověď je v současnosti nejperspektivnější cestou preventivní imunizace u pohlavně získané HIV-1 infekce a snad i prevence vaginální kandidózy.

  4. Příprava a testování efektu DNA vakcín s imunomodulačními molekulami.
    1. izolace OX40L, IFN-a, cDNA a klonování do DNA vakcinačních vektorů.
    2. klonování hsp90, hsp60, gp120 a fúzní Osp cDNA fúzovaných s virální J-doménou do DNA vakcinačního vektoru.
    3. testování specifické humorální a buněčné imunitní odpovědi experimentálních myší na vakcinaci
      1. dvěma DNA vakcínami - jedna kódující antigen a druhá imunomodulační molekulu.
        1. testování optimální dávky obou DNA.
        2. testování optimálního časového schématu pro jednotlivé kombinace.
      2. DNA vakcínami N´terminálně fúzujícími J-doménu s jednotlivými antigeny.
    4. formulace optimálního vakcinačního schématu pro jednotlivé kombinace antigenu a modulační molekuly použitých v DNA vakcínách.
    5. testování efektu imunizačních postupů kombinujících DNA priming a DNA nebo proteinový booster pro jednotlivé antigeny s preferovanou dominancí
      1. antigen specifické systémové humorální odpovědi (hsp90 - systémová kandidóza, gp120 - HIV-1 infekce, fúzní Osp - borelióza).
      2. antigen specifické systémové Th1 buněčné odpovědi (hsp60 - trichofytóza).
      3. antigen specifické mukózní (vaginální) humorální odpovědi (hsp90 - vaginální kandidóza, gp120 – genitální přenos HIV-1).
      4. antigen specifické mukózní (vaginální) Th1 odpovědi (hsp90 – srovnávací postup pro vaginální kandidózu).
    6. testování vybraných imunizačních postupů vzhledem k jejich protektivitě při prevenci experimentální infekce myší (kandidóza, borelióza) a morčat (trichofytóza).
    7. zvážení vhodnosti přípravy bicistronických DNA vakcín v závislosti na výsledcích testů v bodech 4)d)i)(2).
    8. testování cytokinové odpovědi antigen specifických lymfocytů po imunizaci myší DNA vakcínami exprimujícími alergeny Lol-p-I, Phl-p-V a Bet-v-I a imunomodulačními DNA vakcínami (OX40L, IFN-, případně IL-2, IL-12).

      9. Hypotéza: Nalezení optimálních imunizačních podmínek ve smyslu imunomodulačního působení podaných vakcín je nezbytným krokem k indukci vhodné (humorální/buněčná, systémová/mukózní) antigen specifické protektivní odpovědi nejen u studovaných infekčních onemocnění ale i u autoimunitních onemocnění se známým autoantigenem, eventuelně při prevenci alergických reakcí vůči známému alergenu.

  5. Návrh a ověření diagnostické využitelnosti nových technik PCR-detekce bakteriálních patogenů (především v kombinaci s analýzou tání s vysokým rozlišením, tzv. PCR-HRMA).
    1. Vývoj a testování primerových systémů pro amplifikaci sekvenčně variabilních produktů.
    2. Vyhodnocování vhodnosti těchto systémů pro posuzování sekvenční variability produktů na základě dat z analýzy tání s vysokým rozlišením. Pro účely rychlé detekce a identifikace mikroorganismů z klinického vzorku se předpokládá vývoj systémů s co nejširším spektrem záchytu (panfungální u houbových patogenů, resp. broad-range PCR u bakteriálních patogenů), pro detekci markerů virulence a/nebo rezistence vývoj specifických systémů pro nejvhodnější geny, pro účely identifikace a typizace kultur rozvíjení přístupu McRAPD.
    3. Výběr nejvhodnějších systémů v jednotlivých oblastech a ověření jejich diagnostické využitelnosti na modelových klinických situacích:
      1. detekce přítomnosti Mycoplasma pneumoniae a Chlamydophila pneumoniae v různých stádiích chronické obstrukční plicní nemoci,
      2. detekce infekčních agens u hematoonkologických nemocných,
      3. sledování vývoje střevní mikrobiální kolonizace u onemocnění trávícího traktu při podávání probiotik,
      4. hodnocení nozokomiálního šíření vybraných patogenních mikroorganismů na základě výsledků jejich typizace a hodnocení klonální struktury populace,
      5. průkaz faktorů virulence (např. enterotoxinů, TSST-1, Pantonova-Valentinova leukocidinu u Staphylococcus aureus ve vztahu k MRSA, cytolyzinů a hydrolyzujících enzymů u enterokoků ve vztahu k VRE a dalších) a posouzení jejich výskytu u multirezistentních kmenů,
      6. hodnocení korelace výsledků PCR-HRMA analýzy vybraných genů se schopností vybraných mikroorganismů tvořit biofilm,
      7. hodnocení korelace výsledků PCR-HRMA analýzy polymorfismů genů ovlivňujících citlivost k antimikrobiálním látkám s výsledky testování citlivosti k těmto látkám a s klinickou odezvou na léčení těmito látkami.
    4. Standardizace a validace technik pro jednotlivé aplikace.

      5. Hypotéza: Navržené nové techniky umožní časnější detekci přítomnosti mikroba ve vyšetřovaném vzorku včetně identifikace konkrétního druhu a charakterizace jeho klíčových vlastností, což umožní vysoce racionální terapeutický přístup.

  6. Vývoj nového typu specifické, rychlé a nenákladné detekce (diagnostiky) patogenních mikroorganismů založené na měření změny emisního spektra ultratenkých organizovaných vrstev nanočástic kovů, modifikovaných látkami specifickými vůči danému typu patogenů.
    1. Vývoj nové metodiky detekce patogenních mikorganismů.
    2. Standardizace a validace metody pro jednotlivé aplikace.
    3. Vývoj diagnostických souprav.

      4. Hypotéza: Vývoj nové metodiky umožní vysoce senzitivní včasnou detekci přítomnosti mikroba ve vyšetřovaném vzorku.

  7. Řešení problematiky vzniku a šíření bakteriální rezistence.
    1. Navrhnout primery pro amplifikaci vybraných genů patogenních mikroorganismů klíčových pro determinaci rezistence a vyhodnotit možnosti detekce jejich sekvenčních polymorfismů resp. mutací pomocí HRMA.
    2. Analýza faktorů vzniku a šíření bakteriální rezistence pomocí genetických metod.
    3. Analýza selekčního tlaku antibiotik a stanovení míry jeho specifity.
    4. Studium fenotypových a genotypových vlastností ve skupinách citlivých a rezistentních bakterií se zřetelem na výskyt vybraných faktorů patogenity.

      5. Hypotéza: Na základě získaných výsledků bude možné formulovat postupy, snižující riziko vzniku a šíření bakteriální rezistence a zkvalitňující antibiotickou léčbu.

  8. Řešení problematiky nozokomiálních infekcí se zaměřením na pacienty s hemato-onkologickým onemocněním.
    1. Definice zdrojů a cest přenosu multirezistentních bakterií za použití stávajících a vyvinutých molekulárně-biologických metod.
    2. Aktualizace výchozích předpokladů adekvátní antibiotické léčby.

      3. Hypotéza: Na základě získaných výsledků bude možné charakterizovat cesty přenosu multirezistentních bakterií a definovat přístupy snižující četnost nozokomiálních infekcí.

  9. Analýza bakteriální rezistence v animální oblasti, včetně potravin živočišného původu a stanovení míry ohrožení lidské populace.
    1. Analýza výskytu multirezistentních bakteriálních kmenů v animální populaci za použití stávajících a vyvinutých molekulárně-biologických metod.
    2. Definice zdrojů a cest přenosu multirezistentních bakterií.
    3. Získání poznatků vedoucích k ochraně potravinového řetězce člověka před kontaminací multirezistentními bakteriemi.

      4. Hypotéza: Na základě získaných výsledků bude možné specifikovat hlavní rizika ohrožení lidské populace vyplývající z výskytu multirezistentních bakterií v animální oblasti a potravinovém řetězci a definovat postupy vedoucí k jejich omezení.

  10. Vývoj nových typů látek s antibakteriálním a antimykotickým účinkem obsahující nanočástice stříbra.
    1. Optimalizace přípravy a modifikace nanočástic stříbra za účelem připravit látku s vysokými antibakteriálními a antimykotickými účinky.
    2. Optimalizace metodik ke kvantitativnímu testování antibakteriálního účinku.
    3. Studium možnosti vzniku bakteriální či mykotické rezistence vůči přípravkům na bázi nanočástic stříbra.
    4. Optimalizace metodik ke kvantitativnímu testování antimykotického účinku.
    5. Optimalizace metod ke stanovení účinku na bakteriální biofilm.
    6. Analýza možností použití vyvinutých látek v lékařství.

      7. Hypotéza: Na základě publikovaných výsledků v odborné literatuře a rovněž na základě prvních provedených biologických testů na pracovištích UP Olomouc lze předpokládat možnost vývoje nového typu antibakteriálního a antimykotického přípravku na bázi nanočástic stříbra s možností jeho potencionální aplikace v humánní i veterinární medicíně.